呋喃代谢物四合一ELISA检测试剂盒组织蜂蜜

一、原理

呋喃代谢物四合一ELISA检测试剂盒组织蜂蜜版采用间接竞争ELISA方法定量检测样品中呋喃代谢物的残留量。

二、适用范围

定量检测组织、蜂蜜样品中呋喃代谢物的残留。

三、呋喃代谢物四合一ELISA检测试剂盒组织蜂蜜版特点及技术指标

* 检 测 时 间 ：40min-70min

* 试剂盒检测纯阴性样本的背景值＜0.05 ppb；

试剂盒检测样本的灵敏度、准确度和特异性：

四、所需材料

仪器：微孔板酶标仪450 nm/630 nm、均质器、振荡器、氮吹仪、离心机、刻度移液管（10 mL）、天平（感量0.01 g）、离心管（5 mL, 50 mL）

微量移液器：10 µL～100µL、100 µL～1000µL

试剂：乙酸乙酯、去离子水、 浓盐酸 、氢氧化钠

五、 试剂盒组成

注*：标准品A、B、C、D、E

呋喃它酮标准品：0,0.05,0.15,0.45,1.35ppb；

呋喃妥因标准品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；

呋喃唑酮标准品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；

呋喃西林标准品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；A、B标准品各1mL，其余各0.5mL，直接使用。

六、溶液配制

配液1: 洗涤工作液

   用去离子水将20×浓缩洗涤液按1 : 19体积   比进行稀释，用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月，用前一天取出回温。

配液2:  1×呋喃样品稀释液     

   用去离子水将2×呋喃样品稀释液  按1:1体积比进行稀释，用于样本的稀释，配好后在4℃环境可保存六个月，用前一天取出回温。

配液3:  0.1 M HCl

   量取860 μL浓盐酸加去离子水/双蒸水混匀定容至100 mL，浓盐酸挥发在通风橱内操作。

配液4:  0.1 M NaOH

    称取0.4g 氢氧化钠加去离子水溶解定容至100ml。

七、样本前处理                                                   

样本处理前须知：

① 处理完的样品应及时进行下步检测，实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。

② 样本数目超过8个时推荐使用排枪加样。

动物组织、蜂蜜 （稀释倍数：2）

  ① 称取2.0±0.05g均质后的样本，加入8ml

  0.1 M HCl 和400μL 呋喃衍生化试剂，用振荡器充分振荡1min；

    ② 置于37 ℃过夜孵育（大约16h）；

③ 分别加入8 ml 0.1 M NaOH和20ml乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s；

④ 4000r/min，室温（20～25℃/68-77℉）离心5min；

⑤ 取上层10ml乙酸乙酯相至离心管中，于50～60℃氮气流下吹干；

⑥ 加入1.6 ml 1×呋喃样品稀释液（动物组织、蜂蜜），用涡旋仪涡动60s使干燥物溶解，用于分析。

八、 酶标免疫测定程序

• 将所需试剂从冷藏环境中取出，待其*回  升至室温（20～25℃）后方可使用。注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
•  按标准品和样品双孔平行的数量使用微孔。
•  按下列方式点板：

  呋喃唑酮、呋喃西林：

（1）加标准品/样品、酶、抗体：加标准品/样品50µL 到对应的微孔中，加入呋喃酶标物50µL /孔， 再加入呋喃唑酮/呋喃西林抗体50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。

（2）洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250 µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，后一次用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

（3）显色：加入底物液A液50 µL/孔，再加底物液B液50 µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。

（4）测定：加入终止液50µL/孔，用酶标仪立即  测定双波长450/630nm吸光度值。

呋喃它酮、呋喃妥因：

（1）加标准品/样品、抗体：加标准品/样品100µL

到对应的微孔中，再加入呋喃它酮/妥因抗体50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃反应30min。

（2）洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，后一次用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

（3）加酶标物100µL/孔，用盖板膜盖板后置37℃反应30min。

（4）洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，后一次用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

（5）显色：加入底物液A液50µL/孔，再加底物    

液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃反应10min。

（6）测定：加入终止液50µL/孔，用酶标仪立即测定450nm处的吸光度值（建议用双波长450/630nm）检测。

九、 结果判定

以标准品百分吸光率为纵坐标，以呋喃标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呋喃实际浓度。（详见试剂盒专业分析软件，以便进行大量样本的分析计算。）

十、 注意事项

① 洗板拍干后应立即进行下一步操作。

② 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

③ 不使用过了有效期的试剂盒，不交换使用不同批号的试剂。

④ 0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。

⑤ 在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20-30min，反之则减短反应时间。

⑥ 未提及样本请致电本公司技术服务部。

十一、贮藏条件及保存期

    贮藏条件： 2～8℃

保 质 期： 12个月

十二、问题与对策