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0543-3202800山羊痘病毒实时荧光PCR检测试剂盒说明书
【用途】 用于山羊痘病毒核酸的检测。
【试剂】
编号 | 20T | 50T | 保存 | |
裂解液 | 4mL | 10mL | 室温 | A盒 |
无水乙醇 | 4mL | 10mL | 室温 | |
去蛋白漂洗液 | 12mL | 28mL | 室温 | |
洗涤液 | 32mL | 77mL | 室温 | |
洗脱液 | 2mL | 5mL | 室温 | |
蛋白酶K | 0.2mL | 0.5mL | -20℃ | B盒 |
PCR反应液 | 200μL | 500μL | -20℃ | |
引物和探针 | 40μL | 100μL | -20℃ | |
阳性对照 | 30μL | 30μL | -20℃ | |
灭菌水 | 300μL | 300μL | -20℃ |
【山羊痘病毒实时荧光PCR检测试剂盒说明书操作步骤】
1.样本前处理及核酸提取
样本前处理:
取适量皮肤丘疹、肺部病变组织、淋巴结,于灭菌研钵充分研磨,用PBS按照1:3体积稀释成均匀乳剂,经10 000rpm离心3 min。
核酸提取:
(1)取200μL上述样本离心后上清液和10μL蛋白酶K加入一只新的1.5mL离心管,然后加入200μL裂解液,剧烈振荡。(蛋白酶K开盖使用后建议存于2-8℃)混匀5~10秒。
(2)56℃温浴10分钟。
(3)在上述离心管中加入200μL无水乙醇,充分振荡混匀5~10秒。
(4)将步骤3中混匀的液体转移至一只套有收集管的纯化柱上,10 000rpm离心1分钟,弃去套管内液体。
(5)将500μL去蛋白漂洗液加入纯化柱上,10 000rpm离心1分钟,并弃去套管内液体。
(6)将700μL洗涤液加入纯化柱上,10 000rpm离心1分钟,并弃去套管内液体。
(7)可选:重复步骤(6)。
(8)再将纯化柱放回接液管上,13 000rpm离心1分钟。
(9)将纯化柱移到一只干净的1.5mL离心管中。
(10)向离心柱内加50μL洗脱液,室温静置1分钟后12 000rpm离心1分钟,弃纯化柱,离心管内液体中含有基因组DNA。提纯的基因组DNA如果不立即使用,请保存于-20℃。
2. 荧光PCR加样体系(总体系20 μL):将下列试剂加入PCR反应管中。
PCR反应液 引物和探针 | 10μL 2μL |
模 板 灭菌水 | 2μL 6μL |
(注:阴、阳性对照设立,由试剂盒提供的阳性对照、灭菌水直接替换“模板"即可。)
3. 反应程序
在荧光PCR仪上进行以下反应:95 ℃ 180s,循环95 ℃ 5 s,55℃ 10 s,72℃ 20 s,共45次, 每次循环的第三步(72℃ 20 s)收集荧光信号(报告基团“HEX",淬灭基团“BHQ1")。
【结果判定】
1 阈值设定
检测结束后,根据收集的荧光曲线和 Ct值直接读取检测结果,Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2 质控标准
(1) 阴性对照:无Ct值无扩增曲线。
(2) 阳性对照:Ct值≤30.0,并出现典型的扩增曲线。若阴、阳性对照组结果不成立,则视为无效检验。
3 结果描述及判定
阴性 被检样品无Ct值且无明显扩增曲线,判为山羊痘病毒核酸阴性;
阳性 检测样品Ct值≤42.0且出现典型的扩增曲线时,判为山羊痘病毒核酸阳性;
可疑 对于Ct值>42.0的样品且出现典型的扩增曲线或者Ct值≤42.0但无典型的扩增曲线时,应重检,重检Ct值≤42.0且出现典型的扩增曲线时判为阳性,其他情况均判为阴性。
【注意事项】
1.B盒使用之前请*溶解并离心数秒后使用,蛋白酶K开盖使用后建议保存于2-8℃。
2 反复冻融试剂将降低检测灵敏度,尽量减少反复冻融。
3 为避免样本间的交叉污染,模板最后加,加模板时先加阴性对照,再加检测样品,最后加阳性对照,有条件的实验室加模板的移液器应与加其它组份的移液器分开。
4 上机前注意检查确保反应混合液内无气泡,且反应管盖紧,以免荧光物质泄漏区污染仪器。
【生产企业】
企业名称:山东绿都生物科技有限公司
生产地址:山东省滨州市经济开发区黄河二路169号绿都生物工程高科技园
【有效期】本制品有效期为1年,生产日期见包装内侧。
仅供兽医诊断使用
长期提供原核、真核蛋白表达构建服务
长期 提供抗原偶联、 HRP、生物素、糖基化、亲和素、FITC等偶联标记多肽、抗体、抗原、蛋白等服务