猪瘟荧光RT-PCR检测方法的具体操作步骤有哪些?

一、试验前准备

 

1.仪器耗材

 

荧光定量PCR仪、高速冷冻离心机、组织匀浆机、磁力架、无RNase枪头/离心管、研钵、DEPC水、商品化猪瘟荧光RT-PCR试剂盒（一步法，靶标5’UTR保守区，FAM探针）、75%乙醇、无水乙醇。

 

2.对照设置（每批次必加）

 

阴性提取对照（NEC）：无菌生理盐水，同步提取RNA

 

无模板对照（NTC）：DEPC水替代模板RNA

 

阳性对照（PC）：试剂盒CSFV阳性RNA

 

3.安全要求

 

全程戴无粉手套、口罩；样本、废液高压灭菌；枪头一次性使用，严禁跨区带回。

 

二、第一步：样品采集与前处理

 

1.各类样品处理

 

1）组织样品（扁桃体、脾脏、淋巴结很优）

 

取50～100mg组织，加5倍体积DEPC生理盐水，匀浆充分；4℃、3000g离心15min，取上清200μL用于RNA提取分析测试百...。

 

2）EDTA抗凝血

 

混匀后直接取200μL血浆/全血裂解提取。

 

3）口鼻拭子、粪便

 

拭子浸泡1mL生理盐水振荡10min；粪便加1mL生理盐水涡旋，3000g离心15min，取上清200μL。

 

4）细胞培养液

 

反复冻融3次，取200μL上清。

 

2.样品暂存

 

提取前2～8℃≤24h；长期保存-80℃，避免反复冻融。

 

三、第二步：病毒总RNA提取（磁珠试剂盒通用流程）

 

取200μL样品上清加入含裂解液的1.5mL无酶管，涡旋1min，室温静置5min充分裂解。

 

加入20μL磁珠悬液，颠倒混匀，室温吸附10min，每2min轻弹管壁。

 

磁力架静置2min，彻底弃去上清，不要触碰磁珠沉淀。

 

洗涤1：加500μL洗涤液1，重悬磁珠，吸附弃废液；

 

洗涤2：加500μL洗涤液2，重复洗涤1次，吸净全部废液；

 

室温干燥5～10min（禁止完全干透，RNA降解）；

 

加入50μLDEPC洗脱液，65℃孵育5min洗脱RNA；磁力架分离，吸取上清RNA至新无酶管，冰上备用或-80℃保存。

 

四、第三步：荧光RT-PCR反应体系配制（25μL一步法体系，冰上避光操作）

 

配液操作要点

 

按样品数量计算预混液总量：(样品数+3对照)×20μL，统一配制预混液，减少加样误差；

 

预混液涡旋混匀，瞬时离心10s；

 

每管分装20μL预混液，再分别加入5μL对应模板；

 

盖紧管盖，1000g瞬时离心10s，转移至扩增区上机。

 

五、第四步：荧光PCR扩增程序

 

反转录阶段（1循环）：50℃，15min（RNA反转录为cDNA）

 

预变性（1循环）：95℃，10min

 

扩增循环（40个循环）：

 

95℃，15s（变性）

 

60℃，60s（退火延伸，此步采集FAM荧光信号）

 

荧光通道选择：FAM；基线、阈值按仪器自动设置，必要时手动微调。

 

六、第五步：结果有效性判定（整批实验合格前提）

 

阳性对照PC：出现典型S型扩增曲线，Ct值≤32，实验有效；

 

NTC无模板对照、NEC阴性提取对照：无扩增曲线、无Ct值；

 

若对照不满足，整批作废，重新提取复测。

 

七、第六步：待测样品判读标准

 

阳性：出现标准S型扩增曲线，Ct≤38；

 

可疑：38＜Ct＜40，曲线微弱上扬；需重新提取RNA、重复检测；两次均可疑判定阳性；

 

阴性：无扩增曲线，Ct≥40，判定无猪瘟病毒核酸。

 

八、附录：Trizol传统RNA提取简要步骤（无磁珠试剂盒时备用）

 

200μL样品上清加800μLTrizol，剧烈振荡1min，室温5min；

 

加200μL氯仿，振荡15s，静置3min，12000g4℃离心15min；

 

吸取上层水相至新管，加等体积预冷异丙醇，-20℃沉淀30min；

 

12000g离心15min，弃上清，75%DEPC乙醇洗涤沉淀2次；

 

干燥3～8min，30～50μLDEPC水溶解RNA，冰上待用。

 

九、关键质控与注意事项

 

分区操作：样品前处理、核酸提取、配体系、扩增四区工具、枪头、手套完全分开；

 

RNA极易降解：全程低温，操作快速，避免核酸酶污染；

 

气溶胶污染防控：开盖轻柔，离心后再开盖，废液、废管121℃高压灭菌；

 

试剂盒避光保存，酶液冰上放置，避免反复冻融；

 

组织样品匀浆务必充分，否则病毒释放不足导致假阴性。