一、适用范围与原理
检测对象：猪瘟病毒（CSFV，RNA病毒）
方法类型：一步法荧光RT-PCR（TaqMan探针，FAM通道）
原理：反转录+PCR同步进行，探针与靶序列结合后发光，实时监测荧光，以Ct值判定阴阳性。
二、仪器与试剂（提前准备）
仪器
实时荧光定量PCR仪（支持FAM通道）
高速冷冻离心机（4℃，12000g）
涡旋振荡器、金属浴/水浴、冰盒
无RNase离心管（1.5mL、0.2mLPCR管）、滤芯吸头
试剂（无RNase）
无菌PBS（pH7.2–7.4）
RNA提取试剂盒（磁珠法/离心柱法，或TRIzol）
猪瘟荧光RT-PCR试剂盒（含：RT-PCR反应液、酶混合液、CSFV引物探针、阳性对照、阴性对照）
DEPC水、75%乙醇（RNase-free）
三、样品采集与处理（关键防降解）
1.样品类型
选择：脾脏、扁桃体、淋巴结；其次：全血（抗凝）、血清、组织匀浆。
2.组织样品处理（10%匀浆）
取0.1g组织，加0.9mL无菌PBS（1:9，W/V）
充分研磨（匀浆机/研钵）
4℃、12000g离心15min
取上清转移至新1.5mL管，-80℃保存（避免反复冻融）
3.全血/血清
全血：EDTA抗凝，4℃≤24h，长期-80℃
血清：分离后同法保存
四、病毒RNA提取（磁珠法为例，常用）
取200μL样品上清至裂解液管，涡旋1min，室温静置5min
加20μL磁珠，混匀，室温吸附10min（每2min轻摇）
磁力架吸附2min，弃上清
加500μL洗涤液1，重悬磁珠，吸附弃上清
加500μL洗涤液2，重复洗涤1次
磁力架吸尽残液，室温干燥5–10min（不干透）
加50μL洗脱液，65℃孵育5min，洗脱RNA
磁力架分离，取**上清（RNA）**至新管，冰上备用（或-80℃）
传统TRIzol法见文末附录。
五、RT-PCR反应体系配制（一步法，25μL体系）
在PCR洁净区配制，冰上操作，避光。
1.体系配方（单管）
RT-PCR反应液：19.0μL
酶混合液：1.0μL
模板RNA（样品/对照）：5.0μL
总体积：25.0μL
2.配液步骤（N+2管，含阴、阳性对照）
按样品数计算总量：(N+2)×(19+1)μL，配成预混液
涡旋混匀，瞬时离心
每0.2mLPCR管分装20μL预混液
分别加入5μL模板：
样品管：5μL样品RNA
阴性对照：5μL阴性对照RNA/DEPC水
阳性对照：5μLCSFV阳性对照RNA
盖紧管盖，瞬时离心（1000g，10s），放入PCR仪
六、扩增程序设置（GB/T16551-2020标准）
反转录：50℃，15min（1个循环）
预变性：95℃，10min（1个循环）
扩增（40个循环）：
95℃，15s（变性）
60℃，60s（退火+延伸，此步采集FAM荧光）
七、结果判定（严格按Ct值）
1.质控标准（必须满足，否则试验无效）
阴性对照：无扩增曲线，无Ct值
阳性对照：Ct≤32，扩增曲线正常S型
2.样品判定
阳性：Ct≤38，且呈典型S型扩增曲线
可疑：38＜Ct＜40，需复检（重新提取RNA+复测）
阴性：Ct≥40或无扩增曲线
八、关键注意事项（防污染+防假阴/假阳）
分区操作：样品处理→配液→扩增，三区隔离，专用移液器
防RNase：全程无RNase耗材，戴手套、口罩，避免说话
防交叉污染：滤芯吸头、离心管一次性使用；阳性对照最后加
RNA质量：组织样品尽快处理，避免反复冻融；A260/A280=1.8–2.0
仪器校准：PCR仪定期校准温度与荧光通道
附录：TRIzol法RNA提取（传统方法）
200μL样品+800μLTRIzol，涡旋1min，室温5min
加200μL氯仿，涡旋30s，室温3min
4℃、12000g离心15min，取上层水相（约500μL）
加500μL预冷异丙醇，混匀，-20℃静置30min
4℃、12000g离心15min，弃上清
加600μL75%乙醇洗涤，4℃、12000g离心10min，弃上清
重复洗涤1次，吸尽残液，室温干燥5min
加40μLDEPC水+2μLRNase抑制剂，溶解RNA，冰上备用
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武经理
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