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ELISA试剂盒生产标准操作规程

点击次数:3711  发布时间:2012-10-27

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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Shandong Lvdu Bio-Sciences&Technology Co.,Ltd.

地址:山东省滨州市黄河二路169号   绿都生物高科技园    

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一、生产定量 

1.生产材料

1.1 包被液

1.2 磷酸盐缓冲液

1.3 标准品稀释液

1.4 样品稀释液

1.5 封闭液

1.6 抗体稀释液A1

1.7 酶稀释液E1/E2

1.洗涤液

1.底物液A

1.10 底物液B

1.11 终止液

2.使用仪器设备

2.1 冰箱

2.2 生化培养箱

2.3 洗板机

2.4 酶标仪

2.5 涡旋仪

2.6 天平(感量0.01

2.7 氮吹仪

3EL1SA检测方法的建立

3.1 多因素正交试验(抗原*包被浓度及抗体工作浓度的确定)

ELISA实验中必须首先对抗原的*包被浓度以及抗体的工作浓度予以选择,从而达到抗原抗体二者之间的*反应条件。ELISA实验中通常采用正交试验来对二者之间的*反应条件进行确定(实验设计如表2.1)。

2. ELISA加样示意表

抗体稀

释倍数

抗原稀释倍数

1 : 10 000

1 : 20 000

1 : 40 000

1 : 80 000

1 : 160 000

1 : 320 000

1:10000

1:20000

1:40000

1:80000

1:160000

1:320000

具体操作步骤如下:

① 包被将包被抗原用包被缓冲液做系列稀释,每孔取100 mL加入酶标板,包被条件如下:

包被温度 

包被时间 (hour)

□ 4

□ 27

□ 37

□ 2 h

3 h

18h

24h

② 洗板甩去孔内液体,用洗板机洗涤微孔2次(或每孔加入250 mL洗涤缓冲液洗涤),每次静置10 s,zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上拍干;

③ 封闭每孔加入180 mL封闭液,37 ℃放置1.5 h;甩去孔内液体,不经洗涤直接在吸水纸上拍干

④ 烘干:采取再次烘干或者晾干的方式彻底干燥酶标板。烘干:37 ℃倒置(不加盖板膜或用自封袋),每5块板烘干30 min,随着板子数量增多时间相应延长,如100块板,需要烘3 h,一次类推;晾干:底部铺一层干净的A4纸或者吸水纸,倒置板子,在顶层铺一层盖住避光,室温晾18-24h

⑤ 正交试验:根据不同的检测物质采用一步法或两步法进行实验。

1)一步法操作步骤:

取出所需的不同包被浓度的板条,按照设计的对应孔每孔依次加入50 m包被液(零标准)、50 mL 1000倍稀释的HRP酶标物、50 mL系列稀释的抗体,孵育条件如下:

孵育温度 

孵育时间 (min)

□ 室温(25℃)

□ 37

□ 20 min

30 min

洗板甩去孔内液体,每孔加入250 mL洗涤缓冲液,静置20 s后,再次甩去孔内液体。重复洗涤微孔3次,zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干

底物加入底物A 5mL /孔和底物B 5mL /孔,孵育条件如下表:

孵育温度 

孵育时间 (min)

□ 室温(25℃)

□ 37

10 min

15 min

20 min

终止每孔加入50 mL 终止液

读数用酶标仪在双波长450 / 630 nm测定每孔OD值,分析软件分析数据。

2)两步法操作步骤:

取出所需的不同包被浓度的板条,按照设计的对应孔每孔加入50 m包被液(零标准)和50 mL系列稀释的抗体,孵育条件如下:

孵育温度 

孵育时间 (min)

□ 室温(25℃)

□ 37

□ 20 min

30 min

洗板甩去孔内液体,每孔加入250 mL洗涤缓冲液,静置20 s后,再次甩去孔内液体。重复洗涤微孔3次,zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干

酶标物每孔加入100 mL 1000倍稀释的HRP酶标物,孵育条件如下

孵育温度 

孵育时间 (min)

□ 室温(25℃)

□ 37

15 min

20 min

30 min

底物加入底物A 5mL /孔和底物B 5mL /孔,孵育条件如下表:

孵育温度 

孵育时间 (min)

□ 室温(25℃)

□ 37

10 min

15 min

20 min

终止每孔加入50 mL 终止液

读数用酶标仪在双波长450 / 630 nm测定每孔OD值,分析软件分析数据。

针对上述结果,选择OD值在2.200 - 2.500范围内所对应的抗原、抗体稀释倍数,然后根据此条件下建立的标准曲线及IC50值等条件,进一步确定包被抗原和抗体的工作浓度。

3.2 酶标免疫测定程序(标准曲线工作条件的选择)

1)一步法操作步骤:

选择抗原合适包被浓度的板条,按照设计的对应孔每孔依次加入50 m标准品/样品、50 mL 1000倍稀释的HRP酶标物、50 mL合适浓度的抗体,孵育条件如下:

孵育温度 

孵育时间 (min)

□ 室温(25℃)

□ 37

□ 20 min

30 min

洗板甩去孔内液体,每孔加入250 mL洗涤缓冲液,静置20 s后,再次甩去孔内液体。重复洗涤微孔3次,zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干

底物加入底物A 5mL /孔和底物B 5mL /孔,孵育条件如下表:

孵育温度 

孵育时间 (min)

□ 室温(25℃)

□ 37

10 min

15 min

20 min

终止每孔加入50 mL 终止液

读数用酶标仪在双波长450 / 630 nm测定每孔OD值,分析软件分析数据。

2)两步法操作步骤:

选择抗原合适包被浓度的板条,按照设计的对应孔每孔加入50 mL标准品/样品和50 mL合适浓度的抗体,孵育条件如下:

孵育温度 

孵育时间 (min)

□ 室温(25℃)

□ 37

□ 20 min

30 min

洗板甩去孔内液体,每孔加入250 mL洗涤缓冲液,静置20 s后,再次甩去孔内液体。重复洗涤微孔3次,zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干

酶标物每孔加入100 mL 1000倍稀释的HRP酶标物,孵育条件如下

孵育温度 

孵育时间 (min)

□ 室温(25℃)

□ 37

15 min

20 min

30 min

底物加入底物A 5mL /孔和底物B 5mL /孔,孵育条件如下表:

孵育温度 

孵育时间 (min)

□ 室温(25℃)

□ 37

10 min

15 min

20 min

终止每孔加入50 mL 终止液

读数用酶标仪在双波长450 / 630 nm测定每孔OD值,分析软件分析数据。

针对不同条件下产生的标准曲线,选择能够满足要求的抗原抗体工作浓度。曲线要求零标准的OD值在2.200 - 2.500范围内,线性要求大于0.99B点结合率介于75%-90%之间,拐点≤2IC50介于中间标准品内。

3.3注意事项

3.1 将所需试剂从冷藏环境中取出,待其完全回升至室温(2025 ℃)后方可使用。注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

3.2 洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3.3 反应终止液为硫酸,避免接触皮肤。

3.4 生产定量标准

3.4.1  溶液配置体积按照入库数量配置,避免浪费;

3.4.2  零标准的OD值入库时控制在2.200-2.500

3.4.3  标准曲线线性要求大于0.99

3.4.4  标准曲线的拐点≤2

3.4.5  IC50值介于中间标准品内;

3.4.6  B点结合率介于75%-90%之间。

3.5 生产定量要求

3.5.1 入库分装用的试剂配制好后,避免直接使用原瓶试剂,特别是需要多次使用的溶液,应分装出需要体积两倍的溶液单独使用,避免分装用原瓶试剂污染。

3.5.2 配置酶标物的试剂瓶应采用灭菌过的试剂瓶,其余试剂组分不需要采用灭菌试剂瓶。

3.5.3 配置用溶液无论体积多少,使用前均需检查外观是否浑浊或污染,然后再配制半成品溶液。

3.5.4 每生产一批及时填写生产定量批记录表(如下表),由生产部负责备档以便后期追踪审查。

一、 生产检验

1.指标要求

食品安全ELISA试剂盒入库前需满足的指标要求如下:

1.1  零标准的OD值入库时控制在2.200-2.500

1. 2  标准曲线线性要求大于0.99、拐点≤B点结合率介于75%-90%之间;

1. 3  IC50值介于中间标准品内;

1.4  阴性样本背景值≤检测限;

1.5  加标回收率介于70%-130%之间。

2. 检验

2.1生产定量后由生产负责人按照规定的检验指标进行*次检验,并填写试剂盒入库检验报告单,各指标符合要求后转交质控负责人进行复核检验,并填写试剂盒入库检验报告单(如下表)。

2.2 质控合格的由质控负责人签字生产检验单,告知生产部门及时入库。

2.3 生产检验单由质控负责人负责备档以便后期追踪审查。

二、 产品包装

1. 生产部按照要求将检验合格的产品及时分装入库,各试剂核对无误,方可分装;分装时要求环境洁净,分装人需带一次性口罩,分装不同液体使要及时更换枪头并且要慢吸防止倒吸,造成交叉污染。

2. 及时填好生产包装批记录表(如下表),由生产部负责备档以便后期追踪审查。

四、产品质控

1. 半成品管理

1.1 半成品要妥善保存,注明名称,日期,负责人名字,再次使用前检查外观是否浑浊或污染,确认无误后方可使用。

1.2 对放置超过3个月的以及外观不正常的试剂及时清理。

2. 成品管理

2.1 试剂盒分装后,留出一盒48T放置留样库,其余放置成品库。

2.2 由质控负责人按照入库时间计时,隔半月、1.5月、3月、6月及时进行质控,查看标准曲线情况,并填写检测试剂盒质控明细表(如下表),对不符合要求的试剂盒及时通知生产部门解决。

2.3 库存超过三个月的试剂盒根据质控情况更换批次或者更换关键试剂,重新入库,由生产部负责管理,对整改入库的试剂盒及时填写整顿单,由生产部负责备档以便后期追踪审查。

2.4质控报告模板统一,每批次试剂盒的质控曲线,一定注明单位(一般为ppb),采用清晰的截图方式,例如下图所示。

2.5 每个试剂盒均附有一份质控报告,质控报告由质控负责人签字后方可装入试剂盒。

五、发货管理

1. 报单记录

销售人员在明确客户名称、地址、产品、规格、单价、数量等信息后,及时记录报货明细,核对明细后详尽地填制到《发货申请单》上;然后通过、传真、网络等方式报单至相应部门负责人。

2. 销售合同

根据客户需求制作销售合同(如下图),双方达成一致后,待客户按照账户汇款成功后,试剂盒发货相应部门进行备货、制单、发货。

3. 制单

相关部门根据《发货申请单》,编制《发货单》。“发货单”为五联单,即存根联、记账联、出库联、客户联和回单联。*联“存根联”留存,其它四联全部交由销售人员分别送至物流部门及销售会计,进行组织发货及销售台账记账。其中:销售会计接收一联(计账联),物流部门接收其中的三联单据(出库联、客户联及回单联),即:

第二联“记账联”——销售会计接收,用于销售台账的记账及留存。

第三联“出库联”——用于部门内部出库及留存;

第四联“客户联”——随货同行,客户验收货物后签收留存;

第五联“回单联”——随货同行,客户验收货物后签字盖章,留待业务员回收、记账后上交营销中心转销售会计上账后留存;

4. 收单、记录、上账

销售业务人员必须按规定,在60天内将发货单的“回单联”从客户手中回收,回收的“回单联”必须有客户的签收确认(签名/盖章)及业务员签字。若有特殊情况(如回单丢失、金额不符等),则必须由客户出具相关证明材料,注明金额等详情,并签字/盖章,寄回或由业务员带回公司,进行审批、上账。若无客户的证明材料,则由责任业务员在公司财务留存的“送货单(记账联)”上签字确认,承担该批货物的完整接收责任。

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