猪瘟荧光RT-PCR检测方法的原理是什么?

 

第一步为逆转录反应。提取样品中的总RNA，在逆转录酶作用下，以猪瘟病毒RNA为模板，依靠特异性引物合成互补的cDNA。RNA本身不能直接作为PCR扩增模板，逆转录环节就是将病毒RNA转化为稳定的DNA模板。

 

第二步为PCR扩增与荧光信号释放。反应体系内加入一对猪瘟特异性引物以及一条荧光探针。探针5端标记报告荧光基团，3端标记淬灭基团。探针完整状态下，淬灭基团会抑制报告基团发光，无明显荧光。PCR循环包含变性、退火、延伸三个阶段，在延伸阶段，TaqDNA聚合酶发挥5'→3'外切酶活性，当聚合酶沿着模板链延伸时，会将结合在目标序列上的探针水解切断。报告基团和淬灭基团相互分离，淬灭作用消失，随即释放荧光信号。每完成一轮扩增，目标DNA片段数量翻倍，被水解的探针随之增多，荧光强度同步增加。

 

荧光PCR仪器会在每个扩增循环结束时采集荧光信号，自动记录荧光变化曲线。当荧光信号达到设定阈值时对应的循环数称为Ct值。如果样本含有猪瘟病毒核酸，会出现典型扩增曲线，Ct值在判定区间内，判定为阳性；样本无病毒核酸，探针不会被水解，无荧光增长，判定为阴性。利用系列标准品还可建立标准曲线，对样本中病毒核酸进行定量分析。

 

整套方法选择猪瘟病毒基因组高度保守区域设计引物与探针，保障特异性，不会与其他相近病毒发生交叉反应。该检测灵敏度高，能够检出微量病毒核酸，广泛用于疫病监测、样品筛查与野毒感染排查。部分试剂盒采用双探针体系，可同时区分猪瘟野毒株与疫苗株核酸。

 

检测过程中，样本内抑制物、核酸降解、交叉污染会造成假阴性或者假阳性，试验需要同步设置阳性对照、阴性对照，用于监控整个反应体系是否正常。