ELISA试剂盒使用及开发过程中常见问题及对策

现象

可能原因

解决方法

板条不显色或者无相应数值

试剂使用顺序混乱，或操作步骤出错

严格遵循实验说明重复实验

使用了不同批次的试剂

确保试剂来自同一试剂盒

板条受潮严重

板条要封好，干燥剂失效要及时更换

低

吸

光

度

OD

值

试剂过期，或者不同的批次混用

查证过期试剂和批次

洗液配制错误、洗涤浸泡时间过长

按照说明书要求洗涤，并正确配制洗液

孵育时间过短

按照说明书要求，严格计算好时间

试剂污染

确保吸取不同液体更换新的枪头和盛放器皿

试剂温度过低

根据试剂体积大小回温时间相应延长，确保试剂*回温

使用错误波长读数，或者酶

标仪失灵

确保450 nm波长读数，检查酶标仪是否故障

试剂盒处于的条件

使用完毕的部分请立即放回冰箱，勿置于过热环境时间太长

过高的

背景值或吸光度（OD值）

使用了质量差的水配制试剂

使用双蒸水或去离子水配制试剂

洗涤不当或者洗板机洗板效果不好

增加1-2次洗涤，每孔至少加入250μL洗液

酶标仪失灵，如OD值读数很高而颜色很浅

使用校正微孔板检查酶标仪，检查光源

实验室温度过高，反应时间过长

测定操作温度是否合适，时间是否计算正确

试剂混淆，被污染或者配制不当

确保使用正确的试剂，准确配制，避免污染

板内

差异性

大

加入标准品和样品等的时间不一致

使用多道枪加样，同种试剂加样途中不能中断

多道枪使用不当

校准多道枪，检查吸嘴是否套紧，确保吸液量一致

洗涤系统出现故障

检查洗涤系统，保持良好运行

板

间

差

异

性

大

板与板之间孵育时间相差太大

独立计时，确保一致的孵育时间

板与板之间不一致的洗涤过程

确保相同的洗涤次数，保证洗涤系统正常运作

使用移液枪不当

检查移液枪，确保吸取相同液量

试剂和样品处于不同温度

确保盒内试剂和样品液等充分回温，如果试剂体积较大则需要回温较长时间。不能用温水浴回温样品

不同批次的试剂混用，或试剂盒过期

试剂不要混用，通常0标准品的OD值小于0.5显示试剂质量下降

一个或

多个标准品数据点超出曲线范围

标准品添加顺序混乱，或者放置于错误位置

按照说明要求重复实验，保证标准品添加正确

标准品被污染或与其他标准品混淆

改用新的标准品，按照由低浓度到高浓度的顺序添加标准品

洗涤不一致或者洗涤系统失灵

遵循一如既往的洗涤方式，检查洗涤系统

加入标准品和试剂的时间不一致

由低到高浓度依次添加标准品，使用多道枪移液

多道枪使用不当

校准多道枪，检查吸嘴是否套紧，确保吸液量一致